技术支持--常见问题及解答

2009年1月6日 08:28 星期二


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常见问题及解答

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问：琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top
答：琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

　　1、 DNA的分子大小:
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　2、琼脂糖浓度
　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,
DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
　　3、 DNA分子的构象
　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

　　4、电源电压
　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
　　6、离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

问：琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top
答：琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

　　1、 DNA的分子大小:
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　2、琼脂糖浓度
　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,
DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
　　3、 DNA分子的构象
　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

　　4、电源电压
　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
　　6、离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

问：琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top
答：琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

　　1、 DNA的分子大小:
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　2、琼脂糖浓度
　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,
DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
　　3、 DNA分子的构象
　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

　　4、电源电压
　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
　　6、离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

问：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 Top
答：聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。
     PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。
（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）
     电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。
（2）不连续系统对样品的浓缩效应
     凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
     缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。
（3）电荷效应
在分离胶中，各种血清蛋白所带静电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快，反之则慢。因此各种蛋白质按照电荷多少、分子量大小及分子形状以一定顺序排成一个个区带。不连续PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了它的分辨率。
    电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法，其比氨基黑染色法灵敏度高，可以进行定量扫描，比银染法简便。

问：单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析 Top
答：单细胞凝胶电泳(SCGE)又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA 损伤与修复的检测技术。其主要的影响因素如下：
1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。
2．细胞数和实验温度的影响：
（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。
（2）实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。
3．碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；二是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。
电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。
4.荧光染色及彗星图象分析：
(1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。
　　(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。

问：单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析 Top
答：单细胞凝胶电泳(SCGE)又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA 损伤与修复的检测技术。其主要的影响因素如下：
1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。
2．细胞数和实验温度的影响：
（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。
（2）实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。
3．碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；二是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。
电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。
4.荧光染色及彗星图象分析：
(1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。
　　(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。

问：单细胞凝胶电泳分析法（Single Cell Gel Assay） Top
答：单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)，它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
    彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。ＤＮＡ碎段的游动的程度不同使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。这种方法不但可以测出最小的ＤＮＡ碎段，还可以测出被破坏ＤＮＡ碎段的数目，迄今为止，这是最佳分析ＤＮＡ受损害的程度与方法。
    研究人员发现一些可能导致癌症的物质并不一定直接破坏ＤＮＡ，而只是阻碍修补ＤＮＡ的功能，因而准确地测出各种物质对ＤＮＡ修补的影响就显得更为重要了，如果被破坏的ＤＮＡ不及时修复，它就会产生癌病变。直到最近，所有的诊测方法都不能准确地测出某种物质对ＤＮＡ修补的影响。彗星分析法是目前唯一能精确地测出ＤＮＡ修复功能、及可发现致癌物质的方法，在癌症研究上，测出ＤＮＡ的修补能力非常重要。例如，咖啡因一直被怀疑具有致癌性，通过以往传统的实验方法并不能得出肯定的结论，然而，运用彗星分析法，研究人员就可得出这样的结论：虽然咖啡因不直接破坏ＤＮＡ，但它会阻止修补ＤＮＡ的功能，最终可能会导致癌症。
彗星分析法与其它分析法最显著的区别就是：彗星分析法可以对DNA的破坏和自身修补进行定量的分析。也就是说，它能测出DNA被破坏的程度，而其它的测试法只能确定某一种物质是否会致癌，而无法测出致癌程度，更无法测出DNA修补的速度。

问：单细胞凝胶电泳分析法（Single Cell Gel Assay） Top
答：单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)，它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
    彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。ＤＮＡ碎段的游动的程度不同使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。这种方法不但可以测出最小的ＤＮＡ碎段，还可以测出被破坏ＤＮＡ碎段的数目，迄今为止，这是最佳分析ＤＮＡ受损害的程度与方法。
    研究人员发现一些可能导致癌症的物质并不一定直接破坏ＤＮＡ，而只是阻碍修补ＤＮＡ的功能，因而准确地测出各种物质对ＤＮＡ修补的影响就显得更为重要了，如果被破坏的ＤＮＡ不及时修复，它就会产生癌病变。直到最近，所有的诊测方法都不能准确地测出某种物质对ＤＮＡ修补的影响。彗星分析法是目前唯一能精确地测出ＤＮＡ修复功能、及可发现致癌物质的方法，在癌症研究上，测出ＤＮＡ的修补能力非常重要。例如，咖啡因一直被怀疑具有致癌性，通过以往传统的实验方法并不能得出肯定的结论，然而，运用彗星分析法，研究人员就可得出这样的结论：虽然咖啡因不直接破坏ＤＮＡ，但它会阻止修补ＤＮＡ的功能，最终可能会导致癌症。
彗星分析法与其它分析法最显著的区别就是：彗星分析法可以对DNA的破坏和自身修补进行定量的分析。也就是说，它能测出DNA被破坏的程度，而其它的测试法只能确定某一种物质是否会致癌，而无法测出致癌程度，更无法测出DNA修补的速度。

问： Western转印与电泳的常见问题 Top
答： 1、推荐电压条件下电泳时间过长？
可能原因：电泳缓冲液过稀。
建议解决方法：配制新鲜缓冲液，使用1X稀释液。

2、推荐电压条件下电流过高，热量过大？
可能原因：电泳缓冲液过稀。
建议解决方法：配制新鲜缓冲液，使用1X稀释液。

3、推荐电压条件下电流过低或无电流？
可能原因：接触不良。
建议解决方法：在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查buffer core上导线连接。

4、出现蛋白带型条状（streak）？
A、可能原因：上样过量。样品中盐浓度过高。
   建议解决方法：降低蛋白上样量。通过透析或凝胶过滤降低样品中的盐浓度。
B、可能原因：样品沉淀。
   建议解决方法：加大样品中SDS的浓度。
C、可能原因：样品中的污染，如脂类或DNA 复合物。
   建议解决方法：离心或过滤样品以除去特定污染。
D、可能原因：制胶不佳。
   建议解决方法：确保灌胶均匀，一次完成。

5、条带模糊？
A、可能原因：蛋白样品部分变性。
   建议解决方法：完全变性蛋白。
B、可能原因：蛋白样品部分还原。
   建议解决方法：确保加入足够量的DTT或β巯基乙醇。
C、可能原因：电泳时间过长。
   建议解决方法：观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间。

6、出现哑铃形条带或"微笑"条带？
A、可能原因：上样体积过大导致不完全堆积。
   建议解决方法：使用恰当的上样体积。如果样品过稀，使用超滤浓缩。
B、可能原因：电泳过程中电场不均匀。
   建议解决方法：如果蛋白浓度已知，上样时确保对称。
C、可能原因：分离胶表面不平。
   建议解决方法：在制胶时使分离胶表面水平。
D、可能原因：凝胶过期。
   建议解决方法：在指定的失效期前使用凝胶。

问： SDS-PAGE电泳小问答 Top
答： Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？
A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？
A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

Q：为什么带出现拖尾现象？
A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

Q：什么是“鬼带”，如何处理？
A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？
A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。

Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
处理办法：按正确的操作方法操作。

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