常见问题及解答

        针对产品： BG-subMIDI多用途水平电泳仪 BG-Power600型电源 BG-Power600i型电源 BG-power300型电源 BG-verSEQUENCING (H)型DNA序列分析电泳仪（槽） BG-orbitalHS 脱色摇床 BG-highSPIN台式高速离心机 BG-thermoLT干式恒温器 BG-easyPIPET移液器S100 BG-easyPIPET移液器S200 2009年仪器目录 SE600X CHROMA™ 标准垂直电泳仪 SE600 标准垂直电泳仪 SE660 标准垂直电泳仪 SE300 miniVE 迷你垂直电泳仪/SE302 迷你转移芯 TE70X/TE70XP半干转印仪 TE77X/TE77XP 半干转印仪 2D双向电泳系统 TE22冷却式蛋白转印仪 IEF100 等电聚焦系统 BG-easyPIPET移液器S2 RCB20恒温循环器 PS300-B电泳仪电源 RCB20恒温循环器 2720 PCR仪 9700 PCR仪 Amplitronyx 4 PCR仪 Amplitronyx 6 PCR仪 ATC 201 PCR仪 GelDoc-It™ 凝胶成像系统 BioSpectrum®多功能成像系统 TFML-20高性能紫外透射仪 FirstLight®紫外透射仪 CL-1000紫外交联仪 CX-2000紫外交联仪 BG-chillerE05恒温循环器 Thermo-Heraeus公司简介 可见光系列仪器特点及优势 MV-100微型真空浓缩仪 TE42冷却式蛋白转印仪 iBox®小动物成像系统 EC3™多功能成像系统 MicroONE 迷你离心机 MX-201/301落地式高速冷冻离心机 ChipMate 甩片机 SX系列 高压蒸汽灭菌锅 ELx50™自动洗板机 ELx808™ 高级吸收光酶标仪 Pico/Fresco 微量离心机 Biofuge Primo/Primo® 多用途高速离心机 Biofuge® Stratos 全能高速冷冻离心机 Multifuge 3/3R 系列多用途离心机 SI公司简介 Hoefer公司简介 核酸荧光染料GeneFinder™ BG-CAPTURE新一代显微数码图像系统 BG-Power3500多用电源 BG-Vtrans512    可见光凝胶透射仪 BG-Power500HC高电流电泳仪电源 BG-Power600k转印电泳仪电源 重点推荐产品 BG-subMIDI(v)可见光电泳-透射仪 BG-subMINI 迷你水平电泳仪 BG-subMAX 宽式水平电泳仪 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪 BG-power5000型电源 BG-verSEQUENCING (W)型DNA序列分析电泳仪（槽） Bg-stirrer4D1B磁力搅拌器 BG-transBLOT 迷你转移芯 BG-blotMINI 迷你垂直转移槽 BG-tubeCORE 管式电泳芯 BG-stirre4D4B磁力搅拌器 BG-easyPIPET移液器S10000 BG-UTube U型管电泳槽 BG-tubeMINI管式电泳仪 BG-stirre1DB磁力搅拌器 BG-caTANK免疫电泳仪 BG-Qspin™6000转微型离心机 BG-easyPIPET移液器S10 BG-easyPIPET移液器S1000 BG-easyPIPET移液器S5000 EV265电泳仪电源 ChemiDoc-It™化学发光成像系统 多功能涡旋混匀器系列 BioTek公司简介 Nyx公司简介 Thermo公司简介 BG-gdsSAFE    可见光成像系统 BG-Vtrans520    可见光凝胶透射仪 BG-subMIDI(v)可见光电泳-透射仪 BG-thermoRT干式恒温器 KINTARO-24/18微量高速离心机 ELx800™ 通用酶标仪 BG-easyPIPET移液器S20 SE900双向垂直电泳仪 HE33 Mini 水平电泳仪 HE99X Max 标准型水平电泳仪 Agarose西班牙琼脂糖 SE900双向垂直电泳仪 Finnpipette Foucs 移液器 Finnpipette Focus 多道移液器 Finnpipette Novus 电动移液器 Veriti™多重控温PCR仪 HL-2000杂交炉 HM-4000 杂交炉 MS-100微量组织破碎仪 Tomy公司介绍 BG-easyPIPET移液器S50 BG-Qspin™10000转微型离心机 TE62冷却式蛋白转印仪 PS200HC电泳仪电源 PS300-B电泳仪电源 GD2000一体化真空干胶器 STEP ONE荧光定量PCR仪 HB-1000杂交炉 UVP公司简介 ABI公司简介

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最新前 10 个问题

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问： BG-verSEQUENCING(W)问题及分析 Top 答： 一：灌胶时，胶内产生气泡 1．玻璃板清洗不够干净；玻璃板彻底清洗； 2．玻璃板未涂硅烷；清洗后，玻璃板涂硅烷； 3．胶混匀后没有脱气；胶混匀后要脱气； 4．罐胶时左右移动灌胶瓶，使胶匀速进入玻璃内；灌胶要迅速； 5．灌胶时玻璃板倾斜度太大。灌胶时玻璃板倾斜度不能太大，小于15℃或者水平。 二：上槽缓冲液漏液 1.玻璃板装上电泳槽时没有安装好。玻璃板安装要紧贴铝板和槽子。 2.密封条老化。更换密封条。 三：铝板打火 上槽缓冲液漏液。1.重新安装玻璃板，拧紧锁紧螺拴。2. 密封条老化。更换密封条。 四：电压电流不正常 1．缓冲液配制有问题；缓冲液重新配制。 2．胶配制问题；胶重新配制。 3．胶温度过高或过低。增加或降低电压。 五：上槽打火 上槽缓冲液太少，低于最少量。加入足够的缓冲液。 六：下槽打火 下槽缓冲液太少或太多。加入合适的缓冲液。 七：胶粘在两块玻璃板上 1．玻璃不干净。按照说明清洗玻璃。 2．两块玻璃般都没有硅化。按照说明硅化玻璃。 3．两块玻璃般都涂了亲水硅烷。应该是凹玻璃板涂疏水硅烷，平玻璃板涂亲水硅烷。 4．分开玻璃太快。
问： 水平电泳仪问题及分析 Top 答： 一：DNA带模糊 1.DNA降解。实验过程避免核酸酶污染。 2. 电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值降低，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。要经常更换电泳缓冲液。 3. 所用电泳条件不合适。电泳时电压不应该超过8V/cm，温度小于30℃。巨大DNA链电泳，温度应小于15℃。核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4. DNA上样量过多。减少DNA上样量。 5. DNA样含盐过高。电泳前通过乙醇沉淀除去多余的盐。 6. 有蛋白污染。电泳前酚抽提除去蛋白。 7. DNA变性。电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 二：不规则DNA带迁移 1. 电泳条件不合适。电泳时电压不应该超过8V/cm，温度小于40℃。经常更换电泳缓冲液。 2. DNA变性。用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。电泳前勿加热。 三： 带弱或者无DNA带。 1. DNA的上样量不够。增加DNA上样量。 2. DNA降解。避免DNA核酸酶的污染。 3. DNA走出凝胶。缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 4. 对于EB所污染的DNA，所用光源不合适。应用短波长（254nm）的紫外光源。 四：DNA带缺失 1. 小DNA带走出凝胶。缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 2. 分子大小相近的DNA不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。 3. DNA变性。电泳前请勿高温加热DNA链，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 4. DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。 五：样品泳道不直 1. 凝胶没有完全凝固。凝胶凝固至少30~40min。 2. 梳子齿歪了。检查梳子。 3. 凝胶有气泡。制胶时注意凝胶不能有气泡。 六：高分子量条带清楚漂亮，但低分子量条带弥散 胶浓度低：1.使用合适浓度胶。2.换用丙烯酰胺胶来分离。 七：胶融化了 温度太高：1.选择合适电压。2.缓冲液使用次数太多或者配置不对，重新配置。 八：样品条带弥散 1.样品中的盐浓度高。减少样品盐浓度。 2.温度太高。降低电压或者重新配置缓冲液。 3.上样太多。增加胶厚度或者上样要合适。 4.样品降解。重新提取样品。 5.制胶时样品孔破了。重新制胶。 九．相同分子量的DNA不在一条直线上 1.上样后，琼脂糖胶在缓冲液中漂移。 2.电泳槽问题
问： BG-verMINI问题及分析 Top 答： 一：电泳跑的太慢 A.内槽缓冲液要没过凹玻璃板，低于平玻璃板。内槽和外槽缓冲液不能相通。B.电泳缓冲液pH值及浓度是否配制正确。C.分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液pH值及浓度是否配制正确。D. 电压太低，选择合适的电压。E. 样品盐浓度太大，除去样品中的盐。 二：微笑现象 电泳温度太高或者太低，1．选择合适电压；2．加入缓冲液太少，将缓冲液加满；3．如确实需要高电压，可将电泳仪至于4℃冰箱中。 三：蛋白条带歪曲或波浪形 A:凝胶原因：1．胶时，胶中有气泡。2．放入梳子时，梳子下面有气泡；3．分离胶表面不平，一定要用水覆盖； B: 样品原因：1．盐浓度高，透析除盐；2．样品有沉淀，上样前离心。 四：条带不清楚 A. 凝胶原因：1．试剂一定要用高纯度；2．胶配置后不能放置时间太长；3．样品PH不对；4．缓冲液PH不对；5．降低电压或电流。 B. 样品问题：1．样品离子浓度比凝胶中的离子浓度低；使用和凝胶缓冲液一样的样品缓冲液。2．样品浓度太高或低，减少或增加浓度；3．上样前加热样品，加热后马上放入冰水中；4．样品保存在低温中，防蛋白降解。 五：样品跑完浓缩胶，进入分离胶前没有压缩成一条直线 1.浓缩胶和分离胶pH值不正确；2.浓缩胶太短；3.试剂一定要用高纯度；4.样品中钠离子或钾离子浓度高。 六：样品分不开 1．凝胶浓度太大，凝胶浓度太小；调整浓度大小； 2．蛋白亚基没有完全分开，样品缓冲液SDS浓度不够，充分加热。 七：制胶时漏胶 玻璃板没有装好。重新安装玻璃板，锁紧螺丝要拧紧，密封条老化。 八：样品孔之间的凝胶凝固不好 凝固温度低，时间太长。凝胶最好在25℃到30℃之间，凝固时间40分钟到一个小时。 九：电泳太快了 缓冲液浓度低，电压太高。重新正确配置缓冲液；选择合适的电压。 十：电泳结束后，凝胶底部的样品泳道比上部收缩变窄 样品中的离子浓度比胶的离子浓度大，除去样品中的盐。
问： 电源问题及分析 Top 答： 一：电源面板按键不灵. 面膜问题，返回公司更换。 二：风扇噪音大. 风扇使用时间太长，老化。更换风扇 三：电源开机屏幕只显示“一”或者没有任何显示. 电源内部单片机坏，返回公司更换 四：电源开机屏幕乱码. 内部程序出错，返回公司刷新程序 五：电源开机屏幕不断闪烁. 液晶屏损坏，更换液晶屏。 六：电源接任何负载，设置任何电压运行，BG-Power600i和BG-Power 300均显示5V，300mA；BG-Power600显示5V，500mA或者17V，500mA. 内部零件出故障，返回公司维修 七：电源开机设置后运行，听到轻微爆裂声。再开机开不了. 内部零件出故障，返回公司维修 八：电源开机就跳闸. 电源内部零件损坏，返回公司维修 九：电源报警声异常，声音太小. 蜂鸣器有问题，返回公司维修 十：电源开机后，运行报警ERROR CODE:1. A．检查电泳仪连接是否正确；B．电源内部零件出故障，返回公司维修 十一.电源空载不报警. 内部程序出错，返回公司刷新程序 十二.电源运行中途不报警，但没有电流输出. 内部零件出故障，返回公司维修 十三. 电源开机后，运行报警ERROR CODE:5. 电源没有负载，检查电泳仪连接是否正确 十四. 电源开机后，运行报警ERROR CODE:02/03/04/06. 内部零件出故障，返回公司维修 十五. 电源开机后，运行报警ERROR CODE: 09. 电源正常运行状态被异常中止, 按任意键重新运行即可
问： 琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top 答： 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。  　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。  　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:  　　1、 DNA的分子大小:  　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。  　　2、 琼脂糖浓度 　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,  DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。  　　3、 DNA分子的构象  　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。  　　4、 电源电压  　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。  　　5、嵌入染料的存在  　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。  　　6、 离子强度影响  　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。  　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
问： 琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top 答： 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。  　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。  　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:  　　1、 DNA的分子大小:  　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。  　　2、 琼脂糖浓度 　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,  DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。  　　3、 DNA分子的构象  　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。  　　4、 电源电压  　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。  　　5、嵌入染料的存在  　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。  　　6、 离子强度影响  　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。  　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
问： 琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 Top 答： 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium  bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。  　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。  　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:  　　1、 DNA的分子大小:  　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。  　　2、 琼脂糖浓度 　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,  DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。  　　3、 DNA分子的构象  　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。  　　4、 电源电压  　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。  　　5、嵌入染料的存在  　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。  　　6、 离子强度影响  　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。  　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
问： 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 Top 答： 聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。      PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。 （1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）      电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。 （2）不连续系统对样品的浓缩效应      凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。      缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。 （3）电荷效应 在分离胶中，各种血清蛋白所带静电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快，反之则慢。因此各种蛋白质按照电荷多少、分子量大小及分子形状以一定顺序排成一个个区带。不连续PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了它的分辨率。     电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法，其比氨基黑染色法灵敏度高，可以进行定量扫描，比银染法简便。
问： 单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析 Top 答： 单细胞凝胶电泳(SCGE)又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA 损伤与修复的检测技术。其主要的影响因素如下： 1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。 2．细胞数和实验温度的影响： （1） 实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。 （2） 实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。 3．碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；二是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。 电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。 4.荧光染色及彗星图象分析： (1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。 　　(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。
问： 单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析 Top 答： 单细胞凝胶电泳(SCGE)又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA 损伤与修复的检测技术。其主要的影响因素如下： 1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。 2．细胞数和实验温度的影响： （1） 实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。 （2） 实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。 3．碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；二是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。 电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。 4.荧光染色及彗星图象分析： (1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。 　　(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。

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